湖南农大刘次桃/段美娟团队解析耐盐杂种优势之谜

　　 　　

土壤盐渍化严重影响种子萌发、植物生长发育并最终影响产量。盐渍化限制了农业的可持续发展，是一个严重的全球问题。据统计，全球1/3以上耕地受到盐渍化的影响。在我国，盐渍化的农田已达到 1亿公顷，其中有 234万公顷 (如沿海滩涂地区) 可以开发利用。水稻是主要的主粮作物，养活着全世界一半以上的人口，但是水稻对盐胁迫却十分敏感。与常规稻相比，杂交稻通常表现出更强的生物和非生物逆境胁迫的耐受性，以及更强的地域适应性。随着世界人口不断增长，极端气候事件日益频发，开发利用耐盐杂交水稻是提高水稻产量以及满足全球粮食安全需求的有效途径。杂种优势，是指杂交后代在产量、生物量和抗逆性高于其亲本的平均值 (高亲优势)；如果杂交后代的表现优于双亲，则被称为超亲优势。

杂交水稻比其亲本或其他的常规稻高出10-20%的产量。尽管杂交水稻表现出明显的杂种优势，并成功应用于提高产量，但其潜在的遗传机制仍不清楚。杂交种从表达水平上而言，可分为非加性效应 (Non-addtive effect，NAE) 和加性效应 (additive effect)。研究表明，在玉米、小麦、拟南芥和水稻中，NAE在杂种优势中占主导地位。NAE是指杂交种的基因表达量与亲本表达量的均值出现偏差，这就导致在杂交种中表现出显性、部分显性或超显性。

杂交种中来自父母双亲间的等位变异对杂种优势和表型变异起着关键作用。杂交种有大量的基因表达偏向其中一个亲本的表达，表现为等位基因特异性表达 (allele-specific expression, ASE)，并导致了显性和部分显性的效应。此外，杂交种的一些基因在某一个发育阶段或环境中优先表达其中一个亲本的等位基因；但在另一个发育阶段或另一种环境条件下，却转向于高表达另一个亲本的等位基因，这种直接转向的ASE基因 (Direction-shift ASE)，就导致了超显性效应。因此，鉴定杂交种的NAE和ASE基因模式是揭示杂种优势特别是超高亲优势分子机制的主要途径。

近几十年来，高通量测序、数量性状图位克隆、全基因组关联分析以及多组学技术快速发展，科学家已经发现了水稻中许多杂种优势相关基因或位点。杂种优势基因的研究主要集中在生物量、产量以及对环境的适应性，但对于非生物逆境 (如盐逆境) 适应的杂种优势基因或位点却极少研究。因此，鉴定杂种优势中响应非生物逆境如盐胁迫的主效基因，对培育耐盐杂交稻具有重要意义。

近日，湖南农业大学刘次桃/段美娟研究员课题组在JIPB上在线发表了题为“The OsWRKY72–OsAAT30/OsGSTU26 module mediates reactive oxygen species scavenging to drive heterosis for salt tolerance in hybrid rice”的研究论文 (https://doi.org/10.1111/jipb.13640)。

超优千号 (CY1000) 是袁隆平院士研发的第五期超级杂交稻，以产量高，适应性广著称。CY1000的母本“广湘24S” (GX24S) 是湖南杂交水稻研究中心育成的籼型温敏雄性不育系；父本“R900”是广适性恢复系，它是经过从广亲和粳稻品种02428和轮回422进行杂交、回交改良的恢复系，是一个含有较高粳稻血缘的籼稻。与其他籼×籼杂交稻相比，CY1000在产量和盐胁迫中表现出更强的杂种优势。我们对 CY1000 在正常和盐逆境处理的二周龄苗的根系进行了转录组和蛋白质组分析。非加性效应和等位基因特异表达分析发现了CY1000耐盐杂种优势的两个主效基因—谷胱甘肽转移酶基因 OsGSTU26 和氨基酸转运基因 OsAAT30 ，以及它们的上游调控因子OsWRKY72，OsWRKY72通过抑制 OsGSTU26 和 OsAAT30 的表达来调控盐胁迫下的ROS清除。OsWRKY72-OsAAT30/OsGSTU26 模块调节可能是杂交稻耐盐方面表现出超亲优势的主要途径。这一发现为水稻遗传改良和耐盐杂交育种提供了新的理论支持和基因资源。

1．超优千号在耐盐性方面表现出高亲优势

作者通过对超优千号与全国推广面积前30的杂交稻进行苗期耐盐性检测发现，超优千号的耐盐性最好。进一步研究发现，超优千号的耐盐性远强于其父母本，表现出超高亲优势 (图1A-C)。作者在海南三亚市的大田试验研究表明：全生育期在0.3%和0.6%盐度的田间处理，产量可达到8.7吨/公顷和3.2吨/公顷 (图1D, H)。其中，用0.3% NaCl灌溉的CY1000所达到的产量 (8.7吨/公顷) 远超过了袁隆平在2016年“首届国际盐碱稻作论坛”上提出的目标，水稻全生育期用0.3%盐水灌溉条件下的平均产量为4.5吨/公顷。因此，CY1000是研究耐盐杂种优势的优异品种。

图1. 超优千号的耐盐性高于两个亲本

2．NAE分析表明 OsGSTU26 是耐盐杂种优势的主效基因

为检测基因表达或蛋白丰度对耐盐杂种优势的影响。作者以杂交种CY1000基因表达或蛋白丰度与双亲的均值呈现显著差异为标准，鉴定了在盐处理和正常条件下，非加性效应的差异表达基因或差异丰度蛋白。NAE模型分为：超显性效应 (高于或低于双亲)，显性效应 (与双亲中的一个亲本值接近)，和部分显性 (值在双亲之间，但是与均值呈现显著差异)。具体而言，(1) 超显性效应包括：(a) 超高亲，即转录本表达量或蛋白质丰度在杂交种中显著高于双亲；(b) 杂种特异性表达，即基因或蛋白质仅在 F1 杂交种中特异性表达；(c) 杂种沉默，即基因或蛋白在亲本中表达或富集，但在 F1 杂交种中不表达或不富集。(d) 超低亲表达，即转录本或蛋白质丰度在杂交种中显著低于较低的亲本。(2) 显性效应包括：(e) 单亲沉默，只在一个亲本和杂交种中表达或富集。(3) 部分显性效应包括：(f) 偏高亲，即转录本或蛋白质在杂交种中的含量高于含量较低的亲本品系，但杂交种与含量较高的亲本品系之间无显著差异；(g) 偏低亲，即转录本或蛋白质在杂交种中的含量显著低于含量较低的亲本品系。

NAE结果表明：在蛋白水平上，有70个蛋白在盐处理前后，均表现出非加性效应(图2A)；差异蛋白分析表明，有357个蛋白为杂交稻CY1000 (F1) 特异性地响应盐逆境 (图2B)；70个组成型NAE蛋白与CY1000特异性响应盐的蛋白的交集为5个 (图2C)，而这5个蛋白中，仅有一个编码谷胱甘肽S-转移酶的基因 OsGSTU26 在转录和蛋白水平上均表现为超高亲表达 (图2D)。

进一步，对CY1000中响应盐的NAE基因和蛋白交集，获得54个在转录和蛋白水平上均响应盐的NAE基因 (图2E)。这54个基因表现为正超显性效应的基因 (超高亲和杂种特异表达)，再对这54个基因在转录和蛋白水平上进行交集发现仅有5个基因在转录和蛋白水平上均表现出正超显性效应 (图2F)，而这5个基因中，仅有 OsGSTU26 有清除ROS的功能。综上所述， OsGSTU26 可能是CY1000耐盐超亲优势的主效基因。

图2. 超优千号非加性效应分析

3．ASE分析表明 OsAAT30 是耐盐杂种优势的主效基因杂交种双亲的等位变异是杂种优势的遗传基础。为了鉴定CY1000中潜在的遗传变异，作者分析了正常条件和盐处理后的杂交稻CY1000等位基因特异性表达 (ASE) 基因。作者利用CY1000的两个亲本R900和GX24S基因组重测序的数据，统计了CY1000的RNA-seq中所有来自亲本特异的单核苷酸多态性 (single-nucleotide polymorphisms, SNP) 的数量，利用DESeq2软件进行分析，以p < 0.05, Fold Change ≥ 2 定义为父本或母本偏好表达。检测发现：正常条件下，有894个基因为母本偏好表达，912个基因为父本偏好表达。盐处理后，774个基因为母本偏好表达，644个基因为父本偏好表达 (图3A)。值得注意的是，有5个ASE基因的表达偏好发生了直接转向，它们由正常条件下母本偏好表达转变为在盐逆境下父本偏好表达 (图3B, C)。这种在杂交种中表达直接转向的ASE基因通常会导致超显性效应。作者对这5个ASE基因在175份水稻核心种质资源群体中的单倍型 (父本来源单倍型和母本来源单倍型) 与群体对盐胁迫耐受性的表型进行了关联分析，发现只有一个氨基酸转运基因 OsAAT30 与盐的耐受性显性关联 (图3D)。父本来源的 OsAAT30  ^P 单倍型在水稻核心种质资源群体中对盐的耐受性更强。

图3. 超优千号等位基因特异性表达分析

4．OsWRKY72^P抑制 OsGSTU26 的表达；OsWRKY72^M抑制 OsAAT30 的表达为鉴定 OsGSTU26 和 OsAAT30 的上游调控因子，作者利用FIMO软件对 OsGSTU26 启动子和 OsAAT30 基因及其启动子顺式作用元件分析，发现有共同的w-box元件，预测它们共同的上游结合因子是OsWRKY72。进一步体外凝胶阻滞实验 (EMSA, electrophoretic mobility shift assay) 表明：两种基因型的WRKY72都可以结合 OsGSTU26 和 OsAAT30 。双荧光素酶报告 (Dual-Luciferase Reporter, Dual-LUC) 检测发现OsWRKY72^P抑制 OsGSTU26 的表达；OsWRKY72^M抑制 OsAAT30 的表达。

图4. OsWRKY72^P抑制 OsGSTU26 的表达；OsWRKY72^M抑制 OsAAT30 的表达5． OsGSTU26 提高水稻耐盐性， OsAAT30 则对盐敏感； OsWRKY71  ^P 对盐敏感，而 OsWRKY71  ^M 则不改变水稻对盐的耐受性

转基因实验表明：过表达 OsGSTU26 株系通过提高盐逆境下水稻对ROS的清除能力进而提高水稻耐盐性；而过表达 OsAAT30 株系在盐逆境下对ROS的清除能力减弱，导致水稻对盐敏感。过表达 OsWRKY71  ^P 株系抑制耐盐基因 OsGSTU26 的表达，从而导致水稻对盐敏感；而过表达 OsWRKY71  ^M 株系则通过抑制盐敏感基因，导致水稻对盐不敏感，不改变水稻的耐盐性。

图5. 转基因株系耐盐性验证6．CY1000耐盐杂种优势机制小结

转录组、蛋白组学的KEGG通路分析表明活性氧的清除在杂交稻CY1000中富集；同时生理检测也说明CY1000在ROS清除能力上超过双亲。说明ROS清除在耐盐杂种优势特别是超亲优势上扮演着重要的角色。

NAE和ASE分析表明 OsGSTU26 和 OsAAT30 是杂交稻耐盐杂种优势的主效基因，OsWRKY72是它们共同的上游调控因子。源自父本的 OsWRKY72  ^P  通过抑制耐盐基因 OsGSTU26 的表达，导致对ROS清除能力减弱，对盐敏感。源自母本的 OsWRKY72  ^M 通过抑制盐敏感基因 OsAAT30 的表达，导致对ROS清除能力增加，对盐不敏感。另外，单倍型分析表明，父本来源的 OsAAT30  ^P  (BB) 和母本来源的 OsWRKY72  ^M  (AA) 单倍型与水稻核心种质资源群体对盐的耐受性相关。在杂交稻CY1000中，同时有了来源父本的耐盐基因 OsAAT30  ^P ，又有了来源母本的耐盐基因 OsWRKY72  ^M ，这就导致了杂交稻在耐盐性上表现出超显性的效应。OsWRKY72-OsAAT30/OsGSTU26 模块调节可能是杂交稻在耐盐方面表现出超亲优势的主要途径。

图6. CY1000耐盐杂种优势机制小结

湖南农业大学农学院副教授刘次桃为第一作者兼通迅作者。湖南杂交水稻研究中心、杂交水稻全国重点实验室研究员毛毕刚为共同一作。湖南农大段美娟研究员 (现湖南女子学院) 为该文通迅作者。该研究得到国家自然科学基金区域联合基金重点项目 (U21A20208)，国家自然科学基金面上项目 (32272050)，国家耐盐碱水稻技术创新中心项目 (2022PT1005)，湖南省自科基金面上项目 (2022JJ30021)，湖南省科技创新计划 (2023NK1010) 和长沙市科技计划项目 (kq2202221) 的支持。

原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/dMIoKhnXJHRFsP4C-soS9w